Blutzentrale Linz,
Österreichisches Rotes Kreuz Dr. rer. nat. Johannes Pröll
in Kooperation mit:
Roche Diagnostics Austria
Die Transplantationsmedizin verlangt insbesondere für die Übertragung hämatopoetischer Stammzellen eine immer differenziertere Typisierung der Human Leucocyte Antigen (HLA) Loci auf DNA-Ebene. Im Durchschnitt werden pro Monat circa 15 neue Allele beschrieben; um hier „up to date“ bleiben zu können, benötigt man eine Analysenmethode, die auch unbekannte Varianten eindeutig identifiziert, die also beim Primer- oder Probendesign nicht auf bekannte Sequenzen zurückgreift, um die Allele widerspruchsfrei zu benennen. Viele der zur Zeit gängigen Methoden müssen für ihr Primerdesign aber immer wieder auf bekannte Sequenzen zurückgreifen – aufgrund der gewählten Strategie, mittels klonaler Analysenmethode auf Einzelmolekülebene zu arbeiten, können wir diesen „Rückgriff“ vermeiden.
Wir haben eine automatisierbare next generation sequencing Methode für das Genome Sequencer System von Roche 454 Life Sciences entwickelt, die die HLA-Typisierung von sehr ähnlichen Allelen heterozygoter Proben ohne vorherige Trennung erlaubt.
In einer Arbeitswoche von 5 Tagen kann man mit diesem Verfahren den gesamten, 32 Patientenproben umfassenden, Workflow abarbeiten, je nach Automatisierungsgrad annähernd dreimal rascher als mit herkömmlichen Methoden.
Zur halbautomatisierten Auswertung, Reporterstellung und Kontrolle muss man bei 32 Patienten einen weiteren halben Tag einplanen: Zunächst wurden gleiche Variantenmuster mit einer 454-Software (Amplicon Variant Analyzer; 454 Life Sciences, Branford, Connecticut, USA) zu Consensus-Sequenzen zusammengefasst (clustering), um sie dann mit einem externen Programm (Assign 3.5 ATF von Conexio Genomics; Perth, Australien) den jeweiligen Genotypen zuzuordnen (HLA-typing). Wir erhielten bei deutlich vermindertem Zeit- und Arbeitsaufwand dieselben Typisierungsergebnisse wie mit dem zum Vergleich durchgeführten Sanger-Verfahren (ABI Prism).
Um die prinzipiellen Vorteile der next generation sequencing Plattform GS-FLX voll auszuschöpfen und das Verfahren endgültig in die Routine einzuführen, soll in der nächsten Projektphase die Sequenzier-Leseweite erhöht, die Anzahl der parallel analysierten Proben erweitert und die zweistufige Datenauswertung zusammengeführt werden. Auch an der Frontend-Automatisierung der Amplikon Produktion und der DNA-Library Aufbereitung wird gearbeitet und entsprechende, weiterführende Projektanträge befinden sich in der abschließenden Planungsphase.
Letzte Aktualisierung ( Dienstag, 16 Februar 2010 )
